تتمثل آلية العمل في تثبيط تخليق البروتين عن طريق الارتباط بالوحدة الفرعية 30S للريبوسوم في الكائنات الدقيقة المعرضة لـ
وبالتالي، أوكسي تتراسيكلين
يمنع الأوكسيتتراسيكلين ارتباط الريبوسومات بالحمض الأميني المرتبط بالحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA). ويُعتقد أيضًا أنه يرتبط عكسيًا بالريبوسومات 50S، مُغيرًا نفاذية الغشاء السيتوبلازمي للكائنات الدقيقة الحساسة. كما يُمكن للأوكسيتتراسيكلين، بتركيزات عالية، أن يُثبط تخليق البروتين في الخلايا.